Mikrofluidische Sensoren in der Durchflusszytometrie zur kombinierten optisch-elektrischen Analyse an Blutzellen

  • Microfluidic sensors in flow cytometry for combined optical-electrical analysis of blood cells

Simon, Peter; Mokwa, Wilfried (Thesis advisor); Macdonald, R. (Thesis advisor)

Aachen (2016)
Doktorarbeit

Dissertation, Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen, 2016

Kurzfassung

Die Analyse des menschlichen Blutes dient in der humanmedizinischen Diagnostik der Benennung und Klassifizierung von Krankheitsbildern. Die Konzentrationsbestimmung der zellulären Bestandteile einer Blutprobe ist Schwerpunkt der Durchflusszytometrie. Dabei werden je nach Messprinzip optische und elektrische Durchflusszytometer unterschieden.Im Rahmen dieser Arbeit wurden sowohl neuartige mikrostrukturierte durchflusszytometrische Sensoren für kombinierte optische und elektrische Untersuchungen an Blutzellen entwickelt als auch potenzielle Anwendungsgebiete in der klinischen Diagnostik aufgezeigt, die mit konventionellen Methoden bisher nicht durchführbar sind. Die Mikrosystemtechnik begünstigt die Entwicklung von komplexen Elektrodenarrays für elektrische Analysen in transparenten mikrometergroßen Durchflusskanälen, deren hohe Oberflächenqualität die Untersuchung von laserinduzierten Messgrößen erlaubt. Bei der Herstellung der mikrostrukturierten Sensoren wurden sowohl lithografische Verfahren und nasschemische Ätzprozesse zur Formung der Durchflusskanäle als auch Galvanotechniken und Kathodenzerstäubung zur Strukturierung der Elektroden angewandt. Dies ermöglichte die Herstellung eines aus Glas, SU-8 und PDMS bestehenden Sensors sowie drei weiterer, nahezu vollständig auf Glas basierender Sensoren mit hervorragenden optischen Eigenschaften.Die Leistungsfähigkeit der mikrostrukturierten durchflusszytometrischen Sensoren wurde mit fluoreszierenden, monodispersen Mikropartikeln validiert und mit marktüblichen Durchflusszytometern verglichen. Im Ergebnis waren die Empfindlichkeit und die Messstabilität bei den Mikrostrukturen besser oder vergleichbar mit kommerziellen Durchflusszytometern. Zudem wurde eine Charakterisierung der Impedanzeigenschaften von Blutzellen über einem weiten Frequenzbereich bis zu 100 MHz durchgeführt. Damit wurden optimale Frequenzen identifiziert, die mit dem Zellvolumen, der Membrankapazität oder der Leitfähigkeit des Zytoplasmas korrelieren und eine markierungsfreie Differenzierung der Blutzellen ermöglichen. Zur Verifizierung der markierungsfreien Messgrößen diente eine simultane Analyse der Immunfluoreszenz als Referenzmethode. In hämolysiertem Blut konnte durch die kombinierte Messung der Impedanz und der seitlichen Lichtstreuung eine markierungsfreie Differenzierung von Leukozyten-Subpopulationen für das Differentialblutbild erzielt werden. Desweiteren wurde erstmalig eine Differenzierung von Thrombozyten, Erythrozyten, Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten in nicht-hämolysierten Vollblutproben durch die Impedanzmessung erfolgreich durchgeführt. Diese neuartige Methode zur Bestimmung des kleinen Blutbildes und des Differentialblutbildes kommt somit ohne Laser und zugehöriger Optik aus. Bis auf die Verdünnung der Probe entfallen alle weiteren Präparationsschritte. Neben Vollblut von gesunden Probanden wurden im Rahmen dieser Arbeit auch pathologische Proben untersucht, die mit Malaria-Erregern infiziert waren. Ziel war die elektrische Differenzierung von gesunden und infizierten Erythrozyten anhand der pathologischen Änderung des Zell-Innenwiderstandes, die durch den Einfluss des Erregers hervorgerufen wird. Hierzu wurden Plasmodium falciparum Parasiten am Max-Planck-Institut für Infektions-biologie kultiviert und mit klinischen Malaria-Proben von der Charité-Infektionsepidemiologie verglichen. Es zeigte sich, dass befallene Erythrozyten im Trophozoit- oder im Schizont-Stadium durch die Messung der Impedanz markierungsfrei differenzierbar sind. Die Analyse von intraerythrozytären Ring-Stadien, die in klinischen Proben überwiegen, ist dagegen herausfordernd. Impedanzspektroskopische Untersuchungen ergaben, dass sich die Differenzierung der Ring-Stadien mit steigender Frequenz jedoch verbessert und einen schnellen und kostengünstigen Malaria-Befund unterstützt. Eine vollständige Differenzierung aller parasitären Stadien konnte in den Mikrostrukturen mittels Fluoreszenzmessung nach Einfärbung der Erreger-DNA erzielt werden. Nach einem positiven markierungsfreien Befund ist somit eine präzise optische Bestimmung der Parasitenkonzentration zur Überwachung des Krankheitsverlaufs durch die Fluoreszenzmessung am selben Gerät möglich.

Identifikationsnummern